3 基本信息
ICS 11.020
C 61
中华人民共和国卫生行业标准WS/T 633—2018《巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法》（Detection of Babesia spp.——Identification of species by nucleic acidmethod）由中华人民共和国国家卫生健康委员会于2018年09月26日《关于发布〈土源性线虫病的传播控制与阻断〉等6项推荐性卫生行业标准的通告》（国卫通〔2018〕21号）发布，自2019年04月01日起实施。
4 发布通知
关于发布《土源性线虫病的传播控制与阻断》等6项推荐性卫生行业标准的通告
国卫通〔2018〕21号
现发布《土源性线虫病的传播控制与阻断》等6项推荐性卫生行业标准，编号和名称如下：
WS/T 630—2018 日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验
WS/T 631—2018 日本血吸虫毛蚴检测 尼龙绢袋集卵孵化法
上述标准自2019年4月1日起施行。
特此通告。
国家卫生健康委员会
2018年9月26日
5 前言
本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、复旦大学、第二军医大学。本标准起草人：刘琴、周晓农、张仪、胡薇、陈家旭、朱淮民。
6 标准正文
6.1 1 范围
6.2 2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
WS/T 564 巴贝虫病诊断
6.3 3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
巴贝虫 Babesia spp.
一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫，可引起巴贝虫病（babesiosis）。感染人体的巴贝虫种类主要有田鼠巴贝虫 (Babesia microti)、分歧巴贝虫（B. divergens）、邓肯巴贝虫（B. duncani）和猎户巴贝虫（B. venatorum）等（参见附录A）。
6.4 4 仪器和器材
6.4.1 4.1 高速离心机
最大相对离心力为 12 000×g。
6.4.2 4.2 涡旋仪
无级调速范围为 200 r/min～3 000 r/min。
6.4.3 4.3 PCR 扩增仪
温度范围为 4℃～99 ℃，温度精确为 0.1 ℃，热盖为 105 ℃。
6.4.4 4.4 微波炉
6.4.5 4.5 电泳仪
电压为 5 V～5 000 V，电流为 1 mA～500 mA。
6.4.6 4.6 凝胶成像系统
镜头分辨率(H × V)为 1 360 × 1 024，光源为透射 UV。
6.5 5 试剂和材料
6.5.1 5.1 分子生物学试剂
Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、分子质量指示物及核酸提取试剂盒选用商品化产品。
6.5.2 5.2 化学试剂
Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）、琼脂糖凝胶、6×加样缓冲液（参见附录B）。
6.5.3 5.3 引物
扩增巴贝虫 18S 核糖体RNA （18S rRNA）基因和转录间隔区（ITS）基因的特异性引物（见附录C）。
6.5.4 5.4 参照材料
阳性对照为田鼠巴贝虫 peabody mjr 株基因组 DNA。
6.6 6 检测步骤
6.6.1 6.1 样品
6.6.2 6.2 虫种核酸鉴定
6.6.2.1 6.2.1 核酸提取
基因组DNA提取采用商品化全血DNA提取试剂盒（参见附录 B）。
6.6.2.2 6.2.2 18S rRNA 基因扩增
见附录 C。
6.6.2.3 6.2.3 ITS 基因扩增
见附录 C。
6.6.2.4 6.2.4 结果判定
6.6.2.4.1 6.2.4.1 电泳分析
6.2.4.1.1 电泳取第二轮PCR产物 5 µL与 1 μL 6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭替代物的1.0％琼脂糖凝胶中，在1×TAE 缓冲液中，5 V/cm 电泳约 40 min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统或紫外分析仪分析。
6.2.4.1.2 PCR 结果判断6.2.4.1.2.1 PCR 扩增巴贝虫 18S rRNA 基因，出现大小为 400 bp 左右特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带，PCR 结果阳性。PCR 扩增巴贝虫 18S rRNA 基因，未出现大小为400bp左右特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带，PCR 结果阴性。6.2.4.1.2.2 PCR 扩增巴贝虫 ITS 基因，出现大小在 700 bp～2 100 bp 的特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带，PCR 结果阳性。PCR 扩增巴贝虫 ITS 基因，未出现特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带，PCR 结果阴性。
6.6.2.4.2 6.2.4.2 测序分析
阳性 PCR 扩增产物进行双向测序，将序列进行 BLAST 比对分析（见附录C）。
6.6.2.4.3 6.2.4.3 虫种鉴定
7 附录A（资料性附录）病原生物学
A.1 分类
巴贝虫（Babesia spp.）属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoa）、梨形虫亚纲（Piroplasmasina）、梨形虫目（Piroplasmida）、巴贝虫科（Babesiidae）的巴贝虫属（Babesia）。目前已鉴定的有100多种巴贝虫，可以感染牛、马、羊、犬等多种哺乳动物和鸟类。在100多种巴贝虫中，既往已知可以感染人的巴贝虫种类主要有：田鼠巴贝虫(B. microti)、分歧巴贝虫（B. divergens）、邓肯巴贝虫（B. duncani，也称为WA1）和猎户巴贝虫（B. venatorum，也被称为EU1）等。不同巴贝虫虫种引起人体临床症状的比较见表A.1。
A.2 分布
本病呈地方性流行。
在美国，巴贝虫病病例主要发现于马萨诸赛岛、纽约州、康涅狄格岛、加利福尼亚州以及罗得岛。在欧洲，法国、葡萄牙、意大利、波兰、挪威等地均有人巴贝虫病病例发生。另外，在埃及、墨西哥、澳大利亚、日本、韩国、巴基斯坦及南非也均有人巴贝虫病病例报道。在我国云南、河南、新疆、山东、陕西、浙江、江苏、广西、福建及台湾、香港地区等地均有人巴贝虫病病例报道。
| 虫种 | 地理分布 | 媒介名称 | 潜伏期 | 临床特征 | 其他 |
| 田鼠巴贝虫（B. microti） | 欧洲、美国、日本、中国、埃及等 | 肩突硬蜱、卵形硬蜱、全沟硬蜱、丹敏硬蜱 | 1周~6周，甚至3个月以上 | 大多数患者症状比较轻微，只出现一过性的发热症状；而重症患者出现疟疾样症状，包括发热、寒战、肌肉疼痛、贫血、无力、肝脾肿大、溶血性贫血等 | 一般以50岁以上的老人易感 |
| 分歧巴贝虫（B. divergens） | 欧洲 | 篦子硬蜱 | 1周~3周 | 突然起病、血红蛋白尿、黄疸、休克样表现 | 脾脏切除和免疫缺陷者易感 |
| 邓肯巴贝虫（B. duncani） | 欧洲、美国等 | 丹敏硬蜱、肩突硬蜱 | 3周~2个月 | 发热、寒战、肌肉疼痛、贫血、无力、肝脾肿大、溶血性贫血，持续数周或更长 | 脾脏切除患者易感；易输血传播 |
| 猎户巴贝虫（B. venatorum） | 欧洲、中国等 | 蓖子硬蜱、卵形硬蜱 | 不明确 | 大多数患者症状比较轻微，只出现一过性的发热症状；严重者表现贫血、血红蛋白尿、黄疸等症状 | 免疫功能低下者或者脾切除患者易感 |
8 附录B（资料性附录）试剂配制
8.1 B.1 试剂的配制
B.1.1 Tris-乙酸电泳缓冲液（Tris- acetic acid buffer solution，TAE）的配制50× TAE 的配制：三（羟甲基）氨基甲烷（Tris 碱） 242 g， 冰乙酸57.1 mL，0.5 mol/LEDTA( pH8.0) 100 mL，加去离子灭菌水定容至 1 000 mL，混匀 4℃保存备用。
B.1.2 1× TAE 使用液的配制
50× TAE 20 mL加蒸馏水定容至 1 000 mL，混匀备用。
琼脂糖 1.0 g 加1× TAE 定容至 100 mL，微波炉加热完全融化后，溶液冷却至60 ℃，加10mg/mL 溴化乙锭替代物 5 µL（终浓度0.5 µg/mL)，轻轻混匀后，制备凝胶。B.1.4 6×加样缓冲液的配制
溴酚蓝 0.25 g，蔗糖 40 g，加蒸馏水至 100 mL。置于 4 ℃保存备用。
8.2 B.2 DNA的提取
9 附录C（规范性附录）PCR 实验、测序结果分析及标准参考序列
9.1 C.1 PCR扩增引物序列
| 引物 | 引物名称 | 引物序列 a | 片段大小b | 参考文献 |
| 18S rRNA外侧引物 | Bab 5 | 5′-AATTACCCAATCCTGACACAGG-3′ | 400 bp 左右 | [3] |
| Bab 8 | 5′-TTTCGCAGTAGTTCGTCTTTAACA-3′ | |||
18S rRNA内侧引物 | Bab 6 | 5′-GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA-3′ | ||
| Bab 7 | 5′-CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC-3′ | |||
| ITS外侧引物 | ITS-F3 | 5′-GGTGGTGCATGGCCG-3′ | 700 bp～2 100 bp | [4] |
| ITS-R3 | 5′-T(A/T)GCGCTTCAATCCC-3′ | |||
ITS 内侧引物 | ITS-F4 | 5′-GAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCG-3′ | ||
| ITS-R4 | 5′-GCTTCACTCGCCGTTACTAGG-3′ | |||
a 18S rRNA 基因引物序列和 PCR 反应引自 WS/T 564 。 b 不同虫种片段大小不同。 | ||||
9.2 C.2 引物配制
引物用去离子灭菌水配制成100 μmol/L储备液。然后取出一部分，加入相应体积的去离子灭菌水稀释成20 μmol/L的工作液备用。
9.3 C.3 18S rRNA PCR反应体系及反应条件
9.3.1 C.3.1 18S rRNA PCR第一轮反应
C.3.1.1 以引物Bab 5和Bab 8进行第一轮扩增，反应体系为 50 μL。
Taq 酶（5 U/μL） 0.25 μL
10×PCR缓冲液(含15 mmol/L Mg2+) 5 μL
25 mmol/L dNTPs 4 μL
20 μmol/L Bab 5 1.5 μL
720μmol /L Bab 8 1.5 μL
基因组DNA模板（约70 ng） 2 μL
总计 50 μL
C.3.1.2 PCR 条件
95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃7 min；4 ℃∞。
9.3.2 C.3.2 18S rRNA PCR第二轮反应
C.3.2.1 取第一轮PCR产物2 μL为模板，以引物Bab 6和Bab 7进行第二轮扩增，反应体系为50μL。
Taq 酶（5 U/μL） 0.25 μL
10×PCR 缓冲液（含 15 mmol/L Mg2+） 5 μL
25 mmol/L dNTPs 4 μL
20 μmol /L Bab6 1.5 μL
20 μmol /L Bab7 1.5 μL
第一轮PCR产物 2 μL
总计 50 μL
C.3.2.2 PCR 条件
95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72℃ 1 min，共35个循环；72 ℃7 min；4 ℃∞。
9.4 C.4 ITS PCR反应体系及反应条件
9.4.1 C.4.1 ITS PCR第一轮反应
C.4.1.1 以引物ITS-F3和ITS-R3进行第一轮扩增，反应体系为 50 μL。
Taq 酶（5 U/μL） 0.25 μL
10×PCR 缓冲液(含15 mmol/L Mg2+) 5 μL
25 mmol/L dNTPs 4 μL
20 μmol /L ITS-F3 1.5 μL
20 μmol/L ITS-R3 1.5 μL
基因组DNA模板（约70 ng） 2 μL
总计 50 μL
C.4.1.2 PCR条件
95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35个循环；72 ℃10 min；4 ℃∞。
9.4.2 C.4.2 ITS PCR第二轮反应
C.4.2.1 取第一轮PCR产物 2 μL为模板，以引物ITS-F4和ITS-R4进行第二轮扩增，反应体系为50μL。
Taq 酶（5 U/μL） 0.25 μL
10×PCR缓冲液(含15 mmol/L Mg2+) 5 μL
25 mmol/L dNTPs 4 μL
20 μmol /L ITS-F4 1.5 μL
20 μmol /L ITS-R4 1.5 μL
第一轮PCR产物 2 μL
总计 50 μL
C.4.2.2 PCR 条件
95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35个循环；72 ℃10 min；4 ℃∞。注：PCR实验符合WS/T 230的规定。
9.5 C.5 测序结果分析
序列同源性分析利用Blastn（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome），根据序列的相似度，判断样本所扩增序列的巴贝虫种类:
a）18S rRNA 基因序列与GenBank中巴贝虫18S rRNA序列相似度96％以上，或是ITS 基因序列与GenBank中ITS 序列相似度95％以上，判定为巴贝虫；
b） 18S rRNA 基因序列与田鼠巴贝虫18S rRNA序列相似度99％以上，或是ITS 基因序列与田鼠巴贝虫ITS 序列相似度 98％以上，判定为田鼠巴贝虫；
c）18S rRNA 基因序列与分歧巴贝虫18S rRNA序列相似度99％以上，或是ITS 基因序列与分歧巴贝虫ITS 序列相似度98％以上，判定为分歧巴贝虫；
d）18S rRNA 基因序列与邓肯巴贝虫18S rRNA序列相似度99％以上，判定为邓肯巴贝虫；
e）18S rRNA 基因序列与猎户巴贝虫18S rRNA序列相似度99％以上，判定为猎户巴贝虫。
9.6 C.6 标准参考序列
9.6.1 C.6.1 18S rRNA 标准参考序列
C.6.1.1 田鼠巴贝虫18S rRNA 基因参考序列（参考序列GenBank序列号为KU204794，其在该基因中起始位置为405-811）
GACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCTTAAAGTCTTGTAATTGGAATGATGGGAATCTAAACCCTTCCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAGAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCCTTGTCATTAATCTCGCTTCCGAGCGTTTTTTTATTGACTTGGCATCTTCTGGATTTGGTGCCTTCGGGTACTATTTTCCAGGATTTACTTTGAGAAAACTAGAGTGTTTCAAACAGGCATTCGCCTTGAATACTACAGCATGGAATAATGAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTATTGAGCCAGAGTAATGGTTAATAGGAGCAGTTGGG (407 bp)
C.6.1.2 分歧巴贝虫18S rRNA 基因参考序列（参考序列GenBank序列号为KP745627，其在该基因中起始位置为347-725）
GACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCAATTGTCTTGTAATTGGAATGATGGTGACCTAAACCCTCACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTTTGCGTGGTGTTAATATTGACTAATGTCGAGATTGCACTTCG
CTTTTGGGATTTATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGG(379 bp)
C.6.1.3 邓肯巴贝虫18S rRNA 基因参考序列（参考序列GenBank序列号为HQ289870，其在该基因中起始位置为445-842）
GACACCGTGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCTTAAAGCTTTGTAATTGGAATGATGGGAATCCAAACCCCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTCTGCCGCTTGGCCTTCGTTCCCCTTGGGGTTTCGTTCGCCTGGTGGCTTACCTCTGGCGGTGGTTCTCCATTTGCCAGTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTTTTGCCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCAGGACCAAAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGG (398 bp)
C.6.1.4 猎户巴贝虫18S rRNA基因参考序列（参考序列GenBank序列号为KF724377，其在该基因中起始位置为423-801）
GACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCAATTGTCTTGTAAATGGAATGATGGTGACCTAAACCCTCACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATTTATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGG(379 bp)
9.6.2 C.6.2 ITS标准参考序列
C.6.2.1 田鼠巴贝虫ITS 标准参考序列（参考序列GenBank序列号为 AF510198，其在该基因中起始位置为1-828）
TTAAAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCTTATTAGAATTCTATGTATCCGTTTGGGTACGCTGGCCCGTGCGCTTGGTCGCACCTTTTATAGTAGTGGCCTTGGACGTAGCGGCTGCAACTTGTTGGAGCCGCATCCCCGTGGTGGCACAACGCGTCGGAAGGCGGGTTTGTCCGCTATGGGGCGTTCTCACTCCCAAGGTATTTTCCCCGGGCCTCTGTGTTAGATCATTCTAACGGGCTTGGGGGCTATACTGTCATTCGCTGAGAAGTGCCCCCGTGGCTTTCTTGGCTGCTAACGTGGCTTTTCTCGGAAGGTCATGAGGAGCGATTTGTCTAACAACTACTACGAATATTAAACGAAACAAATTTTCAGCGGTGGATGTCTCGGCTCACACAACGATGAAGGACGCAGCGAAGTGCGATAATCATTGTGAATTGCAGAATTTAGCAAATCAACAGGTTTCTGAATGTATTGTACACACTGCCTCTGTTCGCAAGCAGTGCACCCATTTCAGCGCCTCTTAAAATCCTAAAGTATACCTTTTTCCAAGTATGCTTTGTGAGTGGTGCGCAACAGATTTTCTGTGTGTGCATTTAAGTTGGTGTGACTAGACGCGTTTATCACGCAGAAGGTTCTTTGAAACTTGGACTTGTTTGTGTGGTAGATAGTTTAGTTAGTAGCCGCGGCGTAGAGAATACGTTGCTGATGTTTTTATGGCCTGAAATTGGATGTGATGATCCGCTGAATTTAAGCATATAACTAAGCGGAAGAAAAGAAAATAACAATGATTCCCCT(828 bp)
C.6.2.2 分歧巴贝虫ITS 标准参考序列（参考序列GenBank序列号为 EU185801，其在该基因中起始位置为1-1044）
GGACCGTGGCCTTTCCGATTCGTCGGCTTGGCCTAGGGAAGTCTTGTGAACCTTATCACTTAAAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCACATTGAATACCCTTGCACAATAGTGCTCGGCTTCGGCATTTACGTTGTGTAAGCTTGCTTGCAGCTGTGACTCTACGTCATGGTCCACTTTTGGTGGTTTCGTATTTGTC
GTTGCCMTGGCGACGTGGTTTCGGTCTTGTTCCGTTTCCATCCCTGCGCTTTTGCGTGGGACGTTGCCCCCTCCCACCCCACCGGGTGTATGTTTACTGCGGTGTAACTACTGTAGTTGGCGTACACTTGGGTTATGCCGTGTCGATACTGATGTTACTAGTGATTGCTCTTTGAGTGGTTGTTAGTGCTACAGTGTTGTCACGGATGCTGCTCGTGGATCTAATAGATTCAAGCAGTTGCTGCTTCGTGCAGTGTTTTGCGTAGCGATTTCGTTACGATAATGCAACTCCGCTCGTTCATCGTCTTGCGTTGTTCGAGTTTGTTTAGAAATTATAAACTTTCAGCGATGGATGTCTTGGCTCACACAACGATGAAGGACGCAGCAAATTGCGATAAGCATTATGACTTGCAGACTTCTGCGATTTAACAGACCTCTGAACGTAACAAACACACCGCCTCTGCTCGCATGCGGTACTCCCGTTTCAGTGAGCCCCCTTTCCTAAAGGAACCACACTTTTACTCCTGGTAATAGTATGGTTAGTCCTTTGCGAGTGGGTGTTGTGACAATCACCTTAATTTCCATAGCATGCTMCCGGGTATCGCCACGTGTGATCTCGAAGCTTCTTGTTGTAATTTATTACTCTAGGCTTCTTTTGAGATGTGCGGCTAGGAATTACTATTGCAGTATTTCTATAGCAAGTGGATGATGCTAGTGTTGTCAGTGCTATAAGTTTTGAATATCGCTCCTGAAATCGGGTGAGGCTATCCGCTGAATTTAAGCATATAATTAAGCGGCAGAAAAGAAAATAACTAT(1044 bp)
9.7 C.7 巴贝虫PCR电泳结果图
图C.1 巴贝虫临床样品18S rRNA PCR电泳结果图（1-阳性对照样品，2、3-河南田鼠巴贝虫病病例样品，4、5-浙江，云南田鼠巴贝虫病病例样品，6、7-阴性对照和空白对照样品）
图C.2 巴贝虫临床样品ITS PCR电泳结果图（1-阳性对照样品，2、3-河南田鼠巴贝虫病病例样品，4、5-浙江，云南田鼠巴贝虫病病例样品，6、7-阴性对照和空白对照样品）
10 参考文献
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[2] 吴观陵．人体寄生虫学（第4版）[M]．北京：人民卫生出版社，2013，233-237。
[3] Wei Q, Tsuji M, Zamotoet A, et al．Human babesiosis in Japan: isolation of Babesia microti-likeparasites from an asymptomatic transfusion donor and from a rodent from an area where babesiosis is endemic[J]． Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39: 2178-2183．
[4] Holman P, Swift P, Frey R, et al．Genotypically unique Babesia spp. isolated fromreindeer ( Rangifertarandus tarandus ) in the United States [J]．Parasitology research, 2002, 88: 405-411．
[5] 白海鹏，孙维敏，任仟，等．我国巴贝虫病研究进展 [J]．哈尔滨师范大学自然科学学报，2014, 30(5): 100-102．
