2 凍幹皮上劃痕用鼠疫活菌苗製造及檢定規程
2.1 菌種
1.1 菌種來源
用弱毒的EV菌株，由中國藥品生物製品檢定所分發或經同意。
1.2 菌種檢定
凍幹菌種在生產前每年需要檢查一次培養特性、生化特性、噬菌體裂解試驗及安全性。
1.2.1 培養特性
在瓊脂平皿上，37℃培育44～48小時之菌落應爲粗糙型，在肉湯中液麪有薄菌膜，管底有沉澱物，肉湯透明。
1.2.2 生化特性
應分解葡萄糖，產酸不產氣，石蕊牛乳輕度變紅，在甘油培養基內不產酸不產氣。
將EV菌種塗於瓊脂平皿上，加滴度爲10-6以上的鼠疫噬菌體1滴，於28℃培育44～48小時，在噬菌體流過的地方應無本菌生長。
1.2.4 安全試驗
用體重300～400g豚鼠3只，每隻皮下注射120億菌（28～30℃培育44～48小時的培養物）。在注射後第6天解剖1只，第21天解剖2只，檢查注射部位、脾、肝、肺，並用脾、肝、肺及心血進行培育。其中心血和肺培育應無本菌生長。肉眼檢查病變，注射部位可見充血，浸潤變爲膿瘍，肝和脾可有丘疹狀結節，肺部不應有鼠疫特異病變爲安全試驗合格。肺部如有顯著病變時，應用同量豚鼠複試，若仍有顯著病變時，菌種應廢棄。
1.2.5 免疫力試驗
用體得200～250g的豚鼠10只，每隻皮下注射70萬菌（28～30℃培育44～48小時的培養物）一次。於20～25天后進行攻擊，每隻皮下感染鼠疫強毒菌200個MLD。。同時用3組豚鼠作對照，每組3只，各組豚鼠皮下分別注射0.5、1及2個MLD的毒菌。免疫組及對照組至少觀察25天。免疫動物存活不少於8只，而對照動物注射1個及2個MLD全部死亡時，免疫力試驗爲合格。
2.2 菌苗製造
2.1 製造鼠疫活菌苗之實驗室在生產期間應專用，不得作其他細菌工作，絕對禁止保存鼠疫毒菌。
製造菌種可用pH6.8~ 7.2的厚氏瓊脂培養基或其他適宜的培養基。
2.3.1 第1代菌種
啓開乾燥菌種加入生理鹽水溶解後，接種於厚氏瓊脂培養基上，於28～30℃培育44～48小時爲第1代。放2～8℃保存可使用半個月。
2.3.2 第2代菌種
用生理鹽水將第1工菌種洗下，接種足夠量的種子瓶，於28～30℃培育44～48小時爲第2代，供大批生產用。不得用第3代菌種生產。
2.3.3 大量接種
第2代菌種經肉眼檢查無雜菌後，加入適量生理鹽水洗下菌苔，製成均勻的菌懸液，用此菌懸液接種培養瓶，於28～30℃培育44～48小時後，逐瓶肉眼檢查，有雜菌者廢棄。
2.3.4 採集
用由蔗糖、明膠、硫脲、味精及尿素組成的保護液洗下菌苔（洗菌前將凝固水倒去）或將菌苔刮入上述保護液內，製成原液。每瓶原液均應按《生物製品無菌試驗規程》進行純菌試驗，不得有雜菌生長。
2.3.5 合併、稀釋、分裝
用4層紗布或絹布將純菌試驗合格之原液過濾合併，按中國細菌濁度標準比濁後用保護液稀釋，使稀釋後每人份含菌數7億～9億。然後按10或20人份分裝於安瓿，並進行凍幹。採集至凍幹，原液不得超過7天，合併後的原液應按《生物製品無菌試驗規程》進行純菌試驗。
2.4 菌苗分批
同一日培育的原液於同一次冷凍乾燥者爲1批。如1批有數瓶，應分亞批。
2.3 凍幹
菌苗分裝後應立即在-30℃以下進行冷凍。乾燥時間可根據水含量及活菌數來決定。乾燥完畢後進行真空封口，亦可充氮封口。
2.4 成品檢定
本品爲白色或淡黃色疏鬆體。用真空測定器檢查安瓿應爲真空。菌苗水分含量不得超過3%。加入生理鹽水後應在半分鐘內溶解成均勻懸液。
4.2 濃度測定
菌苗經稀釋後，按中國細菌濁度標準（7億/ml）測定濃度。皮上劃痕用菌苗每人份含菌數爲7億～9億。
4.3 活菌數測定
由生產部門會同質量檢定部門進行。每亞批取3支安瓿，加生理鹽水溶解後，混勻比濁，稀釋至10億/ml。再按10倍系列稀釋至10-6。用10-6稀釋度懸液接種5個平皿，每個平皿接種0.1ml。塗勻後放28～30℃培育2～3天，計算活菌數。凍幹後活菌率不少於45%爲合格。如低於45%時可複試，如仍不合格則該批菌苗應廢棄。
4.4 純菌試驗
每批菌苗按《生物製品無菌試驗規程》進行。
4.6 安全試驗
由生產部門會同質量檢定部門進行。每亞批菌苗取2支安瓿，用生理鹽水溶解後，用體重300～400g豚鼠2只，每隻皮下注射120億菌，第6天稱豚鼠體重（不應比原體重減輕1/5以上）並取其中1只解剖，另1只觀察到21天解剖。檢查項目及要求均同1.2.4項。
4.7 免疫力試驗
每10批菌苗抽檢，10批以下者每3～5年至少檢查1次。由生產部門會同質量檢定部門進行。用體重250～300g豚鼠10只，每隻皮下注射5000萬菌，注射後20～25天以200個MLD的鼠疫毒菌進行皮下攻擊。同時有3組豚鼠作對照，每組3只，分別於各組豚鼠皮下注射0.5、1和2個MLD。各組動物於注射後，觀察25天。免疫動物活存不少於8只，而對照動物注射1個和2個MLD全部死亡時，免疫力試驗爲合格。
2.5 保存與效期
應保存於2～8℃暗處。自凍幹後活菌數檢定合格之日起效期爲1年。
3 凍幹皮上劃痕用鼠疫活菌苗使用說明書
嚴禁注射！
本品爲白色或淡黃色的疏鬆體。另入氯化鈉注射液後在半分鐘內完全溶解。
3.1 接種對象
3.2 用法
1.菌苗按所載人份量加入氯化鈉注射液溶解。每安瓿20人份加入1.0ml，10人份加入0.5ml，溶解後應在3小時內用完。
2.在上臂外側上部皮上劃痕接種。在接種處用酒精棉消毒，待酒精幹後滴上菌苗（每人份滴0.05ml）。用消毒針劃成“井”字。劃痕長度約1～1.5cm，應以劃破表皮稍見血跡爲宜。劃痕處用針塗壓10餘次，使菌液充分進入痕內。接種後局部應裸露至少5分鐘。
3.14週歲以下兒童，菌苗滴2處劃2個“井”字，14週歲以上者菌苗滴於3處劃3個“井”字。“井”字間隔2～3cm。
3.3 反應
接種後反應輕微，少數人劃痕處出現浸潤，一般不影響勞動，個別人體溫可能稍有增高。
3.4 禁忌
2.妊娠期或前6個月授乳期。
3.5 注意事項
1.本品僅供皮上劃痕用，嚴禁注射。
2.安瓿有裂紋、標籤不清、製品過期失效者不可使用。
3.6 保存
應保存於2～8℃暗處。
4 參考資料
- ^ [1] ．"《中國生物製品規程》 "．