4 淚液表皮生長因子的醫學檢查
4.1 檢查名稱
4.2 分類
4.3 化驗取材
唾液、淚液
4.4 淚液表皮生長因子的測定原理
ELISA的原理是基於抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體保持其免疫學活性，抗原或抗體的酶結合物既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成抗原抗體複合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變爲有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由於酶的催化效率很高，故可極大地放大反應的結果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
4.5 試劑
ELISA的主要試劑爲固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體和與標記酶直接關聯的酶反應底物。這些試劑的製備比較複雜，在臨牀檢驗中均採用商品的試劑盒，其中配有該項測定中所需的全部試劑。但國內某些商品中僅提供主要試劑，操作者需自作固相的包被和一些溶液的配製。目前國內常用的ELISA檢驗主要是以辣根過氧化物酶（HRP）爲標記物的微孔板法，本文以此法爲主，敘述其技術要點。
完整的ELISA試劑盒應包含以下各組分：①已包被抗原或抗體的固相載體。②酶標記的抗原或抗體（結合物）。③酶的底物。④陰性對照和陽性對照（定性測定），參考標準和控制血清（定量測定）。⑤結合物及標本的稀釋液。⑥洗滌液。⑦酶反應終止液。
4.6 操作方法
ELISA爲多反應、多試劑、多步驟的檢驗方法，必須嚴格按照要求細心謹慎操作，否則得不到準確的結果。用於檢測不同項目的ELISA操作雖略有差別，但均包括加樣、保溫、洗滌、比色等步驟，以下敘述各步驟的操作要點。
（1）試劑準備：按試劑盒介紹要求，稀釋或配製試驗中需要的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用於洗滌的，應爲新鮮和高質量的。自配的緩衝液應該用pH計測量。從冰箱取出的試驗用試劑溫度應達到室溫後使用。在用HRP作爲標記物的試驗中，不可用被金屬污染的容器。
（2）加樣：按要求準備包被好的ELISA板。血清（或體液）標本應該是新鮮採集的或在冰箱中妥善保存的，高度溶血或混濁的標本不宜使用。含疊氮鈉作爲防腐劑的標本不可用於HRP標記的一步法ELISA。加樣時應將標本加在孔底，避免加在孔壁上部，並注意不可濺出，不可出現氣泡。定量測定中加樣量的準確度應達到定量要求。在定性測定中有時不強調加樣量的準確性，例如規定爲加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管，並保持正確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。加酶結合物和加底物的操作和要求與加標本相同。
（3）保溫：在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本後和加結合物後。此時反應的溫度和時間應按規定力求準確。保溫容器最好是水浴，ELISA板底應貼着水中，使溫度迅速平衡。各ELISA板不應疊在一起。爲避免蒸發，板上應加蓋。也可將板平放在底部墊有溼紗布的溼盒中。溼盒應該預溫至規定的溫度，如用保溫箱保溫，空溼盒的預溫更爲重要。
（4）洗滌：洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定着成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附於固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA測定的反應過程中應儘量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。在洗滌液中加入吐溫一類物質可提高洗滌的效果。洗滌如不徹底，特別在最後一次，如有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗淨，也將與酶標抗體作用而產生干擾。
ELISA板的洗滌一般採用以下方法：①吸乾反應液；②將洗滌液注滿板孔；③放置2min，略作搖動；④吸乾或傾去孔內液後在吸水紙上拍幹。洗滌的次數一般爲3～4次，有時甚至需洗5～6次。也可使用板式ELISA自動洗滌儀，但應該先檢查儀器的實際使用效果。洗滌儀的每枝吸液管必須同樣貼近相應孔的底部，以保證各孔的洗滌效果相同。
（5）顯色和比色：在定量測定中加入底物後反應的溫度和時間仍應按規定力求準確。但在定性測定中反應一般可在室溫中進行。如底物爲OPD，應避光放置。反應時間也不需嚴格控制，有時可根據陽性對照和陰性對照的呈色情況而及時加終止液。爲確保各孔的反應時間相同。加終止液的程序和速度應與加底物液時一致。
定性測定如陰性反應呈色淺淡，有時可用目視判斷結果。板式ELISA一般均用酶標測讀儀在規定的波長測讀吸光度。自動酶標測讀儀使用前應先測試與所用ELISA板各孔的匹配性和結果的重複性。
比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物的孔）和空白孔（以生理鹽水或PBS代替標本作全過程測量的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其後可用空白孔校零點，測讀標本孔，標準品孔和控制品孔的吸光度。如仍以蒸餾水校零點，在計算時需將以上各孔的吸光度減去空白孔的吸光度。
4.7 正常值
0.75～7.1ng/ml。
4.8 化驗結果臨牀意義
EGF可促進角膜鹼燒傷后角膜上皮的再生，但不能阻止角膜上皮反覆剝落繼發角膜上皮的糜爛。用於治療近視的準分子激光屈光性角膜切削術（PRK）及放射狀角膜切開術後淚液。EGF含量明顯升高，並逐漸恢復爲正常，推測其原因是升高的淚液EGF促進角膜傷口的癒合。
4.9 附註
ELISA中的主要試劑成份如抗原、抗體、酶結合物、底物等，如製備不當或保存不妥，均易變質失活。ELISA的步驟多，操作如不合規範，難於得到準確的結果。因此爲保證檢測的有效性，每次試驗必須進行質量控制。優良的試劑盒中提供的陽性對照和陰性對照一般可作爲試驗的質控品，按其說明操作，從所得的吸光度值可以判斷試驗的有效性。以臨牀檢驗中最常用的HBsAg檢測爲例，試劑盒中的陰性對照應爲HBsAg陰性的人血清，陽性對照應標明HBsAg含量（例如9±2ng/ml）。每批試驗應同時作3份陰性對照和二份陽性對照。陰性對照測定所得吸光度值應小於某一數值（例如0.100），而陽性對照吸光度均值減去陰性對照吸光度均值應大幹某一數值（例如0.200）。這些數值爲該試劑盒在規定的測定條件下，特定的實驗值。因此如測定結果符合要求，既表明所用試劑的有效性，又表明操作的正確性，只有在這種情況下，該批試驗方爲有效。
有的試劑盒中所含陽性對照和陰性對照不符合作爲質控品的要求，或實驗室的測定條件如比色計等，與試劑盒說明中的不同，則應根據實際情況採用合適的質控品和從實驗得出的本實驗室的質控值。商品的質控血清價格昂貴。定性測定ELISA的質控品一般可自行製備。仍以HBsAg檢測爲例。陰性對照可取自用高質量試劑檢測爲HBsAg陰性的獻血員。陽性對照的製備可在陰性對照血清中加入適量的HBsAg陽性血清，將此混合血清與參照標準品或定量質控品作對比測定，標定其HBsAg含量。然後進行適當的稀釋，得到所需濃度的HBsAg陽性血清，再加入適量抗菌防腐劑如慶大黴黴素和柳硫汞後，分裝低溫凍存。